sábado, 2 de octubre de 2010

Tinción de Gram

Tinción Gram


  • Microscopio
  • Portaobjetos
  • Cubreobjetos
  • Asa de siembra
  • Cubeta de tinción
  • Cultivo bacteriano
  • Pinzas
  • Frasco lavador
  • Mechero de alcohol
  • Papel de filtro
  • Cristal violeta
  • Lugol
  • Alcohol-acetona
  • Safranina

REALIZACIÓN

  1. Preparar los frotis bacterianos.
  2. Teñir con cristal violeta 1min.
  3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
  4. Cubrir con Lugol 1min.
  5. Lavar con agua el exceso de Lugol.
  6. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparación deje de perder color (30seg)
  7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.
  8. Teñir con safranina 1min.
  9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.
  10. Secar la preparación.
  11. Examinar al microscopio fijándose sobre todo en el color de cada preparación.

Los tiempos de exposición a los colorantes son orientativos. Cada vez que se prepara la batería de colorantes para realizar la tinción Gram presentan algunas diferencias respecto a los preparados en otro momento, por lo que puede ser necesario ajustar los tiempos.
En un laboratorio de Microbiología, cada vez que se preparan los colorantes, se suelen hacer pruebas con cultivos patrón de los dos tipos (Gram+ y Gram-) para ajustar así los tiempos y tener la certeza de que el resultado de todas las tinciones que se hagan mientras duren esos colorantes son fiables.
Otra posibilidad es adquirir el equipo completo de colorantes ya preparados, pero es mucho más caro.



El microscopio

El Microscopio óptico compuesto


PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO

  • Sistema óptico
    • OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo.
    • OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta.
    • CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.
    • DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
    • FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
  • Sistema mecánico
    • SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.
    • PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.
    • CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular, …..
    • REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos.
    • TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto.

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO

  1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones.
  2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
  3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.
  4. Para realizar el enfoque:
    1. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.
    2. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.
  5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.
  6. Empleo del objetivo de inmersión:
    1. Bajar totalmente la platina.
    2. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.
    3. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de x40.
    4. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.
    5. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.
    6. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.
    7. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.
    8. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.
    9. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación.
    10. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.
MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES
  1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda.
  2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo.
  3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica.
  4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio.
  5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción.
  6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina, revólver y condensador).
  7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular.
  8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol.
  9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos.http://www.joseacortes.com/practicas/microscopio.htm

Prueba de la Ureasa

Prueba de la Ureasa


Google

Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de amoniaco por acción del enzima ureasa. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado.

Se cultiva el microorganismo en slant en agar urea de Christensen. Este medio se complementa después del autoclavado con 50ml/l de urea. Ésta será degradada por aquellos microorganismos capaces de producir el enzima ureasa. Esta degradación produce amoniaco que hará variar el color del indicador de amarillo a rojo, poniéndose así de manifiesto la actividad ureasa.

Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo de incubación ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio poco después de la inoculación y sus resultados deben ser leídos en las primeras 2-6 horas, mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubación.

Rojo de Metilo/Voges-Proskauer

Rojo de Metilo/Voges-Proskauer



Estas dos pruebas forman parte del IMVIC de las colimetrías y permiten la diferenciación dentro de las enterobacterias del grupo coli y aerógenes. Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarán la glucosa en dos fases: primero la metabolizarán aerobiamente (respiración oxibióntica) consumiendo rápidamente el oxígeno del medio, para, en segundo lugar, continuar metabolizándola por vía anaerobia (fermentación). Ésta puede ser de dos tipos:

  • Fermentación ácido mixta: La realizan las bacterias del grupo de E.coli y los productos finales son ácidos orgánicos (ácidos fórmico, acético, láctico y succínico) que provocan un fuerte descenso del pH inicial del medio. Puede detectarse por el viraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillo por encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4.
  • Fermentación butilén glicólica: La realizan las bacterias del grupo Klebsiella-Enterobacter (antiguo aerógenes). Los productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, produciéndose acetoína como intermediario que podrá ser detectada añadiendo al medio KOH (reactivo A de Voges-Proskauer) y alfa-naftol (reactivo B de Voges-Proskauer) que reaccionarán con este compuesto produciendo un color rojo característico.

Para la realización de estas dos pruebas se cultiva el microorganismo en caldo RMVP (medio de Clark y Lubs) y se incuba a 30ºC durante un periodo de 3 días como mínimo y 5 como máximo. Al revelar las pruebas, se separa el cultivo en dos porciones de unos 2,5ml que servirán para cada uno de los ensayos.

  • Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le añade unas gotas (4-5) de solución indicadora de Rojo de Metilo. Se agita para homogeneizar y se observa la coloración. Se considera positiva si vira al rojo y negativa si permanece amarillo. Foto de los resultados de esta prueba
  • Voges-Proskauer: A la otra porción de cultivo se le añade:
    • 0,6ml del Reactivo A de Voges-Proskauer (alfa-naftol 5% en etílico absoluto). El medio adquiere un aspecto lechoso.
    • 0,2ml del Reactivo B de Voges-Proskauer (KOH 40%). Desaparece el aspecto lechoso y se agita fuertemente.
    Si la prueba es positiva, antes de cinco minutos aparece un color rosado-violáceo, más o menos intenso, que se inicia en la parte superior del tubo. Si la prueba es negativa no aparece coloración alguna.

Prueba de la Oxidasa

Prueba de la Oxidasa



Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Asímismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa, ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno (ver prueba de la catalasa) que se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación es tóxica.

La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para

  • Identificar todas las especies de Neisseria (+)
  • Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias.

El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es menos tóxico y mucho más sensible que el correspondiente compuesto dimetilo (reactivo de Gordon y McLeod), pero es más caro. Este reactivo tiñe las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a púrpura-negruzco intenso.

Realización de la prueba:

  1. Método en placa directa
  • Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda la placa y no invertirla.
  • Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reacción se produce en unos 10-15 segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos.
  1. Método indirecto sobre papel
  • Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri.
  • Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.
  • Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado.
  • La reacción de color positiva se pr

Manitol movilidad nitratos

Manitol-Movilidad-Nitratos


Se incluyen en este apartado 3 pruebas bioquímicas debido a que se pueden realizar cultivando el microorganismo en un único medio, el Manitol Movilidad, que se prepara en tubo con agar recto y se siembra en picadura, incubándose a 37ºC durante 24 horas. También existe la posibilidad de hacer las pruebas en otros medios y por separado.

Prueba del Manitol

Sirve para detectar si los gérmenes son capaces de fermentar el manitol liberando productos ácidos que serán detectados gracias al indicador rojo de fenol que cambiará a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol movilidad incluye 7,5 g/l de D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las enterobacterias, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae. Entre las bacterias de importancia clínica, la prueba del manitol sirve para diferenciar Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-).

Prueba de la Movilidad

Sirve para determinar si un organismo es móvil o inmóvil. Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos aunque existen algunas formas de cocos móviles.

El medio manitol movilidad permite la realización de esta prueba gracias a ser semisólido ya que presenta solamente 3,5 g/l de agar. En estas condiciones, las bacterias móviles producirán un enturbiamiento homogéneo del medio debido a la distribución aleatoria de los microorganismos. Por el contrario, las bacterias inmóviles permanecerán en la misma línea de la picadura en que se sembraron.

Entre las enterobacterias, la movilidad nos permite diferenciar el género Klebsiella (-) de las restantes que suelen ser movilidad (+).

Dentro del género Bacillus, nos permite diferenciar B.anthracis (-) de otras especies generalmente (+).

Prueba de la reducción de nitratos

Sirve para determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos. Para ello, el medio manitol movilidad incorpora 1 g/l de potasio nitrato y para revelar la presencia de nitritos después de su incubación se añaden los reactivos A y B de Griess-Ilosvay en cantidades iguales (1ml aprox.). Un cambio de color (rojo) dentro de los 30 seg indica prueba completa con resultado positivo. Si no cambia de color, se agrega directamente al tubo una pizca (unos 20mg) de polvo de cinc purísimo, totalmente exento de nitratos o nitritos, y se observa el cambio de color durante otros 30 seg, al cabo de los cuales se realiza la interpretación final.

Las enterobacterias son generalmente nitratos (+). Esta prueba se utiliza principalmente para diferenciar entre sí determinadas bacterias de los géneros Haemophylus y Neisseria.

Foto de los resultados de manitol-movilidad
Foto de los resultados de nitratos

Prueba de la Lactosa

Prueba de la Lactosa


Esta prueba se usa para diferenciar entre las enterobacterias en general y el grupo de las coliformes. Se trata por tanto de una prueba de gran importancia debido a que los coliformes se utilizan como organismos indicadores de contaminación fecal en análisis, sobre todo, de aguas. En bacteriología se define el grupo de organismos coliformes como los "bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no formadores de esporas y que fermentan la lactosa con formación de gas a 35ºC en 48 horas". No se trata de un grupo taxonómico e incluye una gran variedad de bacterias, la mayoría de ellas de origen intestinal.

Una manera sencilla de realizar la prueba de la fermentación de la lactosa en enterobacterias es sembrar el microorganismo en agar McConkey, ya que este medio, además de selectivo frente a bacterias no entéricas, es diferencial ya que contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro).

En agar McConkey las bacterias Gram positivas ven inhibido su crecimiento debido a la presencia de sales biliares y cristal violeta y sólo crecerán las enterobacterias, pero entre ellas las que fermenten la lactosa (coliformes) liberarán productos ácidos que producirán un cambio de pH que se detectará gracias al rojo neutro. Las colonias lactosa (+) aparecerán de color rojo o violeta contrastando con la coloración amarillenta de las colonias lactosa (-).

Prueba del Indol

Prueba del Indol


Google

Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano. Dicha liberación se debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante el enzima triptofanasa.

Para la realización de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas en un caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundante triptófano). Para la posterior detección del indol se usa el reactivo de Kovacs que se puede preparar con los siguientes ingredientes:

  • Alcohol amílico o isoamílico (puede sustituirse por alc.butílico)........150ml
  • p-dimetilamino-benzaldehído..........................................................10g
  • HCl (concentrado).........................................................................50ml

Se disuelve primero el aldehído en el alcohol y después se agrega lentamente a esta mezcla el ácido. Para el control de calidad del reactivo se pueden utilizar cultivos conocidos. Las más convenientes son Escherichia coli (indol+) y todas las especies de Klebsiella (indol-).

Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al añadir al medio 5 gotas del reactivo de Kovacs, se producirá un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la prueba será considerada positiva. Si esto ocurre después de 24 horas, la prueba se considera completa, pero si es negativo deberá incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba. Por ello es conveniente hacer siempre la prueba no en el tubo incubado sino en una porción de unos 2ml que se retira de él asépticamente.

Citrato de Simmons- Prueba del citrato

Prueba del Citrato


Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.

Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.

prueba de la catalasa

Prueba de la Catalasa


Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus.

Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:

  • Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).
  • Bacillus (+) de Clostridium (-).
  • Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-)

Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos técnicas:

  1. Método del portaobjetos (recomendado):
  • Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio.
  • Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo.
  • Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).
  • Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.
  • Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.
  1. Método del tubo de ensayo:
  • Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en slant densamente inoculado.
  • Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).

Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dará un falso resultado positivo.


Preparación de colorantes

Preparación de colorantes


  1. Acido-Alcohol: (decolorante para tinción Ziehl-Neelsen)
    • Ácido clorhídrico concentrado ..........................................................3 ml
    • Etanol 95% ....................................................................................97 ml
  2. Azul de metileno: Colorante de contraste para tinción de flagelos.
    • Azul de metileno................................................................................1 g
    • Agua destilada...............................................................................100 ml
  3. Azul de metileno de Loeffler: Tinciones simples.
    • Solución de hidróxido potásico al 1%.................................................1 ml
    • Azul de metileno, sol. saturada en etanol al 95%...............................30 ml
    • Agua destilada...............................................................................100 ml
  4. Colorante para esporas:
    • Solución acuosa saturada de verde malaquita
  5. Colorante para flagelos de Leifson:
    • Solución A
      • Fucsina básica .........................................................................1,2 g
      • Etanol 95%.............................................................................100 ml
    • Solución B
      • Ácido tánico................................................................................3 g
      • Agua destilada.........................................................................100 ml
    • Solución C
      • Cloruro sódico..........................................................................1,5 g
      • Agua destilada.........................................................................100 ml
        Para preparar la solución de uso, se mezclan cantidades iguales de las soluciones A, B y C y se guarda en frasco cerrado herméticamente en la nevera donde es estable durante varias semanas.
  6. Cristal violeta: Para tinción Gram y tinción simple.
    • Cristal violeta (violeta de genciana)....................................................0,5 g
    • Agua destilada.................................................................................100 ml
  7. Eosina: Para observación de células sanguíneas.
    • Eosina...............................................................................................0,3 g
    • Ácido acético glacial......................................................................0,025 ml
    • Agua destilada...................................................................................100 ml
  8. Fucsina diluida: Para tinción Gram y tinción simple.
    • Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen......................................................10 ml
    • Agua destilada.................................................................................100 ml
  9. Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen: Para tinción ácido-alcohol resistente.
    • Fucsina básica......................................................................................1 g
    • Etanol 95%........................................................................................10 ml
    • Fenol 5% en solución acuosa............................................................100 ml
  10. Hematoxilina: Para observación de células sanguíneas.
    • Hematoxilina.........................................................................................2 g
    • Agua destilada......................................................................................1 l
  11. Lactofenol: Para preparaciones microscópicas en fresco de mohos.
    • Ácido láctico.....................................................................................100 ml
    • Fenol................................................................................................100 g
    • Glicerol.............................................................................................200 ml
    • Agua.................................................................................................100 ml
  12. Lactofenol al Azul Algodón: Para preparaciones en fresco y tinciones de mohos.
    • Solución de azul algodón
      • Sol. saturada de azul algodón (azul anilina soluble)......................10 ml
      • Glicerol.....................................................................................10 ml
      • Agua.........................................................................................80 ml
        Mezclar esta solución con lactofenol a partes iguales
  13. Lugol: Solución de yodo para tinción Gram.
    • Yodo...................................................................................................1 g
    • Yoduro potásico..................................................................................2 g
    • Agua destilada.................................................................................300 ml
  14. Orceína A: Tinción de cromosomas.
    • Orceína................................................................................................2 g
    • Ácido acético.....................................................................................45,8 ml
    • Ácido clorhídrico 1 mol/l......................................................................8,3 ml
    • Agua..................................................................................................45,8 ml
  15. Orceína B: Tinción de cromosomas.
    • Orceína................................................................................................2 g
    • Ácido acético.....................................................................................55 ml
    • Agua..................................................................................................55 ml
  16. Safranina: Colorante de contraste para tinción Gram (preferible a la fucsina) y esporas.
    • Safranina.........................................................................................0,25 g
    • Agua destilada..................................................................................100 m
  17. Sudán III: Tinción específica de grasas.
    • Alcohol etílico...................................................................................100 ml
    • Sudán III...................................................................................hasta saturación
  18. Verde de metilo acético: Igual composición que la eosina (num. 7)